活菌數是益生菌產品的重要屬性之一，因為活菌數可能會影響益生菌產品的效果。活菌數不僅對于益生菌企業和消費者具有重要的意義，對于監管部門而言也十分重要。

　　那么活菌數要怎么檢測呢？除了平板培養以外，還有什么其他方法嗎？

　　今天，我們共同關注活菌數的檢測，希望本文能夠為相關的產業人士和諸位讀者帶來一些啟發和幫助。

　　活菌檢測

　　目前，益生菌行業公認的益生菌定義，是 2001 年聯合國糧食及農業組織/世界衛生組織聯合工作組提出的：益生菌是指當攝入足夠數量時，會對宿主產生健康益處的活性微生物1。因此，根據定義，“活性”是益生菌的一個重要特性。

　　此外，我國 2005 年發布的《益生菌類保健食品申報與審評規定（試行）》中第十二條也明確規定了，活菌類益生菌保健食品在其保質期內活菌數目不得少于106CFU/mL(g)。

　　因此，準確測定益生菌產品中的活菌數量，對生產商和消費者，以及監管部門來說，都意義重大。

　　目前，我國益生菌行業主要依據《食品安全國家標準-食品微生物學檢驗-乳酸菌檢驗 GB4789.35—2016》對活菌數進行檢測。該標準采用了培養法來檢測食品中的活菌數。

　　不過隨著技術的不斷發展，當前出現了一些檢測活菌數量的新方法，其中一些方法具有一定的應用前景，有機會在未來廣泛應用于益生菌產品的活菌檢測。今天，我們將介紹幾種用于活菌檢測方法，并探討不同方法的優劣之處。

　　基于分離培養

　　平板計數

　　平板菌落計數法是指將樣本進行適當的連續稀釋后，取一定量的稀釋樣液涂布到平板上進行培養，對菌落形成單位（CFU）進行計數，得到現存活菌數量的估計值，并表示為每克或毫升原始樣本的菌落形成單位的方法3。

　　該方法的關鍵在于恰當的原始樣品的稀釋倍數——將培養后的細菌菌落控制在 30-300 個為宜。

　　這種活菌檢測的方法，是當前應用廣泛、經典的微生物學檢測技術之一，除了被應用于檢測食品中的活菌數，它還常常被用于水質的檢測4。該方法具有成本低、易操作的巨大優勢，但同時也有一定的局限性。

　　平板菌落計數法存在耗時長，難以應付生長緩慢、活的“不可培養的”微生物的缺點。不僅如此，隨著益生菌相關研究的不斷深入，未來將出現越來越多樣的微生物菌種（菌株），對于這些沒有培養過的菌株，試驗條件都需要摸索與嘗試。

　　除此之外，該方法測定的結果是總活菌數量，無法準確區分益生菌產品中不同菌株細菌的活菌數目，而當前越來越多的益生菌產品采用多菌株，因此急需其他活菌檢測方法來彌補上述缺陷。

　　基于基因表達活性

　　qPCR

　　轉錄組可以反映出微生物的活力狀態，因此，當前有一些研究人員開始嘗試利用細菌的信使 RNA（mRNA），來測定活菌數目。

　　定量逆轉錄 PCR（RT-qPCR）是一種用于檢測基因轉錄情況的常見研究方法。在該方法中，信使 RNA（mRNA）先通過逆轉錄酶轉錄成互補 DNA（cDNA）。隨后，以 cDNA 為模板進行 qPCR 反應。因此，我們可以選取微生物特定基因的 mRNA 作為檢測靶標，利用該方法對樣品中的活菌數目進行測定。

　　為提高基于 mRNA 檢測方法的準確性，RT-qPCR 可與疊氮碘化丙錠染色（PMA，可選擇性標記死細胞）和 16S rRNA 測序等技術聯用5，設置死菌陽性對照組，區分出活菌。

　　目前已有一些文獻采用這種方法來檢測產品中的活菌數量，比如廣泛應用于畜禽養殖中的糞腸球菌6。

　　此種基于基因表達活性的檢測方法，具有靈敏度高、特異性強、快速的優勢；但樣品制備過程中的微小變化，都會影響終的測定結果，對實驗環境和操作人員的要求較高。同時，還需要根據不同的微生物，制定不同的檢測靶標和對應標準。

　　圖.流式細胞儀

　　流式細胞分選技術

　　隨著技術的發展，流式細胞分選技術已經成為生命科學領域的常見實驗手段之一。在染色或熒光標記的基礎上，可以使用流式細胞分選技術對細菌進行計數。

　　流式細胞分選技術是一種利用高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的現代細胞分析技術，它可根據發射光的熒光強度和波長將發光顆粒亞群分開，并可實現單克隆分選，從而對復雜樣本中的細胞進行分類、定量和分離。

　　流式細胞分選技術具有精確度高，速度快，允許一次檢測大量細菌，可對不同的細菌進行分選，檢測活菌不同的生理活性和細菌大小的優勢7。

　　但由于流式細胞分選技術復雜昂貴，目前主要應用于科學研究，尚未普遍用于益生菌產品的活菌數檢驗，不過國外已有以此作為出廠檢測標準的先例。

　　圖.拉曼光譜結合人工智能快速鑒定微生物

　　拉曼光譜檢測方法

　　1928 年，在研究單色光穿過透明液體介質時，印度物理學家 C.V. Raman 次發現，入射光中很少一部分光子，與介質產生了非彈性碰撞，即入射光照射在介質上時，與介質的分子或原子發生了能量交換，散射出來的光與入射光的振動頻率不同——這就是著名的拉曼光譜效應。

　　在這一理論基礎上，發展起來的分析技術被稱為拉曼光譜技術，可廣泛應用于液體、氣體和固體的檢測，且可獲得振動頻率為 50-4000cm-1的分子指紋信息8。因此，它已被廣泛用于多個領域的化學及生物分子的鑒定與研究中，如食品檢測、生物醫藥、環境衛生和石油化工等。

　　拉曼光譜技術也可用于活菌計數。有研究人員曾利用活菌與死菌表面電荷的不同，在活菌表面吸附銀離子后進行還原，測試其拉曼增強信號，結果顯示經完全滅活的細菌，幾乎沒有拉曼增強信號，而活菌表面的拉曼增強信號，則非常豐富，以此來辨別活菌9。

　　還有研究人員將分離培養與拉曼光譜技術相結合，以重水制備的營養肉湯培養沙門氏菌，進行氘元素標記，并與共聚焦顯微拉曼光譜聯用，以氘元素特征拉曼光譜峰，監測區分沙門氏菌為死菌還是活菌10。

　　該技術可從分子水平上，精確反映樣品的化學成分組成和分子結構差異，并且表面增強拉曼光譜技術、共聚焦顯微拉曼光譜技術的出現，使得其在分析鑒定過程中，更加直觀、易于觀察和控制，并且結果更加顯著，這些優勢極大地促進了拉曼光譜技術的發展。

　　不過由于該技術還在研究之中，所以仍有一些問題需要克服。比如該技術難以區分不同組分拉曼峰的疊加，易出現某些待測物質峰被掩蓋，造成某些組分信息不能完全展現，從而影響終結果的準確性。

　　目前，有許多研究人員正在積極克服這些局限性，推動拉曼光譜技術的應用，并認為該方法有望成為替代培養法的新一代活菌數檢測方法。

　　其他方法

　　細菌的產物

　　除了拉曼光譜之外，還有一些新型的檢測活菌的方法。益生菌在生長和發酵過程中，可能會分泌一些物質或放出一些氣體，在這些生物標記物的基礎上，也可以通過檢測活菌產生的分泌物或氣體的量，間接確定活菌的數目。

　　潛在的可用于活菌檢測的分泌物有：III 型分泌蛋白 SpaO、蛋白質前體易位酶等11。

　　此外，一些益生菌會產生短鏈脂肪酸等酸性物質，使樣品的 pH 值降低，用溴甲酚紫、酚酞、硝基酚等作為 pH 指示劑，或利用高精度的 pH 計，檢測 pH 值的變化量，從而換算出產酸量，并推算出活菌數目12。

　　這類新型的檢測方法想象空間巨大，但目前仍然很不成熟，并且利用生物標記物區分死活菌的標準仍不全面。但是，相信在不久的將來，這些活菌檢測手段會逐漸成熟，為我們檢測活菌數提供更多的可能。